Nature：发育中的小鼠大脑结构图谱

哺乳动物的大脑是通过空间线索的复杂相互作用发展起来的，这些空间线索是由可扩散的分子、细胞间的相互作用和内在的遗传程序协调产生的，这些遗传程序最终促进一千多种不同的细胞类型的产生。要完全理解这一过程，需要系统地描述整个大脑发育的时空范围内细胞的不同状态。单细胞RNA测序和空间转录组学是揭示神经系统内复杂分子异质性的重要手段。

为了达到对小鼠发育阶段神经系统更高精度的空间转录组分析，2021年7月28日，瑞典卡罗林斯卡学院Sten Linnarsson研究组与Gioele La Manno（第一作者）发表文章Molecular architecture of the developing mouse brain，通过单细胞RNA测序、空间转录组分析等方法揭开了发育过程中小鼠的大脑不同细胞状态的图谱。

目前关于小鼠神经系统全脑以及特定脑区的发育过程的分析已经初见进展【1-6】，但是关于小鼠从原肠形成到出生的胚胎小鼠大脑的完整单细胞转录组图谱的建立仍然非常关键。为此，作者们对胚胎时期E7到E18每天的小鼠脑进行液滴基础的单细胞RNA测序（Droplet-based single-cell RNA sequencing）。在移除低质量的细胞后，作者们共得到93个样品中292,495个细胞，每个细胞平均包括5,766个转录本和1,934个基因。其中32%的细胞处于细胞周期，因此转录的细胞周期激活特征是双模的。分裂后的细胞未发生剪接的新生RNA的比例要大于剪接后的成熟RNA。通过使用更新后的Cytograph pipeline分析流程，作者们共建立了798个细胞群（图1）。作者们根据假定的主要细胞类别例如成纤维细胞、血管、免疫、胶质细胞、成胶质细胞、神经母细胞和神经元，以及不同的细胞亚类、细胞身份和空间位置进行了手动标注和整理（图1）。细胞主要按胎龄进行组织，不同的分支中会显示出主要的神经上皮谱系，主要的细胞种类会随着发育年龄而产生持续的波动。该图谱结果揭示出哺乳动物大脑的协调发展。

图1 发育中小鼠全脑细胞图谱

随后，作者们将目光集中在了原肠胚形成的晚期阶段与神经胚形成的早期阶段，为此提取了该图谱中E7-8.5天的数据。根据构建的系统发育树，可以将细胞分为主要的五个主要组分。这些细胞包括被Pou5f和T标记的原条阶段，Foxa2和Krt8标记的非神经谱系限定的细细胞以及Pax6和Hes3标记的早期神经上皮祖细胞。进一步的，作者们对神经上皮细胞群进行了进一步地分类和定义，根据空间分布模式以及不同的基因表达，可以区分出十个亚群。在原肠胚形成过程中，神经板（Neural plate）的前后轴是通过一些外源信号建立的。相反，在神经胚形成过程中，大脑的形态发生是由一种被称为次级组织者（Secondary organizers）的特殊神经前体细胞发出的内在信号协调的。作者们对E9-11天的放射状胶质细胞群中的次级组织者进行鉴定发现这些次级组织者细胞群亚型中大量差异表达转录因子、分泌配体和表面受体。这些结果建立了一个丰富的次级组织者的数据库，可以是分泌因子的不同组织，以区域特异性的方式进行作用，从而诱导局部产生不同的神经元命运。

细胞分类树中包括胶质细胞和相关的神经前体细胞，其中主要包括表达神经源性的细胞标记物，另外一些表达胶质细胞相关的细胞标记物的。这两组细胞中有超过7000个基因存在差异表达，胶质细胞中优先表达星形胶质细胞和少突胶质细胞相关基因。作者们所建立的图谱揭示出神经源性向胶质源性转变发生在E12和E16之间（图2）。进一步地，为了对神经系统细胞谱系发育过程中发育时间相联系，作者们建立了一个伪时间细胞谱系发育树。作者们对所有特定的细胞群进行分离，并将每个轨迹中的单个细胞投射到胚胎的伪发育年龄上。作们发现跟预期的结果相同，其中只有前脑细胞对发育轨迹有一定的贡献。

图2 小鼠发育过程中神经系统中神经源性细胞向胶质细胞的转变

发育中的大脑由表达特征性转录因子的不同空间域组成。随着发育时间的推移，这些区域逐渐细化。为了将此复杂的发育过程与细胞转录状态联系在一起，作者们对发育过程中小鼠E10.5胚胎的24个矢状面切片的119个基因进行了原位杂交测序（Hybridization in situ sequencing）【7】（图3）。作者们使用计算方法Tangram对单细胞群与空间结构进行对应，为每个细胞状态生成一个空间定位轮廓。这一空间定位将会对不同的细胞群体进行更为精确的空间位置的定义。

图3 小鼠神经系统发育过程中原位杂交测序工作流程

大脑发育的一个核心问题是神经元多样性的起源。作者们发现放射状胶质细胞在空间上和转录水平上都具有多样性，并且多种分泌因子的存在为指定神经元细胞类型和命运提供了更为精确的局部线索。作者们所建立的图谱只观察到87个神经胶质细胞亚型、171个神经节母细胞亚型和306个神经元亚型。但其中存在放射状胶质细胞到神经节母细胞的转变：细胞周期停止后，剪接的活性显著增加并且出现了新的转录因子模块的表达。该转变过程在大多数谱系中保守存在。该结果表明神经前体细胞中次级组织者广泛的促进不同神经细胞的图示形成。

总的来说，作者们所建立的小鼠大脑发育过程转录组图谱提供了小鼠胚胎时期大脑转录组的多样性，这是对哺乳动物神经系统发展进行研究的关键步骤。另外，该图谱中所提供的发育时间、细胞谱系以及区域特异性的基因表达为遗传靶点的研究提供了关键工具，也为理解神经发育相关的疾病例如脑癌提供了重要平台。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-03775-x

参考文献

1 La Manno, G. et al. Molecular Diversity of Midbrain Development in Mouse, Human, and Stem Cells. Cell 167, 566-580.e519, doi:10.1016/j.cell.2016.09.027 (2016).

2 Pollen, A. A. et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell 163, 55-67, doi:10.1016/j.cell.2015.09.004 (2015).

3 Nowakowski, T. J. et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science (New York, N.Y.) 358, 1318-1323, doi:10.1126/science.aap8809 (2017).

4 Zeisel, A. et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell 174, 999-1014.e1022, doi:10.1016/j.cell.2018.06.021 (2018).

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6 Telley, L. et al. Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex. Science (New York, N.Y.) 364, doi:10.1126/science.aav2522 (2019).

7 Gyllborg, D. et al. Hybridization-based in situ sequencing (HybISS) for spatially resolved transcriptomics in human and mouse brain tissue. Nucleic acids research 48, e112, doi:10.1093/nar/gkaa792 (2020).

来源：BioArt