关键词:
橙皮苷
脑出血
丰富环境
铁死亡
Nrf2/Gpx4通路
小鼠
摘要:
目的探讨橙皮苷联合丰富环境对胶原酶诱导的脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)模型小鼠的神经保护作用及铁死亡相关作用机制。方法将90只C57BL/6J小鼠按随机数字表分为假手术组、脑出血组、丰富环境组、橙皮苷组、丰富环境+橙皮苷组(联合干预组)、联合干预+Nrf2特异性抑制剂ML385(抑制剂组)共6组,每组15只。抑制剂组、脑出血组、丰富环境组、橙皮苷组、联合干预组小鼠尾壳核内注射0.075 U/μLⅦ型胶原酶溶液0.5μL(用0.9%NaCl溶液溶解)建立ICH模型,假手术组小鼠注射等体积0.9%NaCl溶液。橙皮苷组、联合干预组、抑制剂组小鼠给予橙皮苷溶液(0.5%羧甲基纤维素钠溶解)灌胃,假手术组、脑出血组、丰富环境组小鼠给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。抑制剂组腹腔注射ML385(30 mg/kg,5%DMSO溶解),其余各组均腹腔注射等体积5%DMSO溶液。灌胃、腹腔注射均在造模手术结束后6 h内完成,1次/d,共14 d。丰富环境组、联合干预组、抑制剂组小鼠在EE鼠笼饲养,假手术组、脑出血组、橙皮苷组小鼠在普通鼠笼饲养。以上干预结束后,所有小鼠均进行神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS评分)。并分别进行脑含水量检测、普鲁士蓝染色,ELISA法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,Gpx4),PCR和Western blot分别检测核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、Gpx4 mRNA、蛋白水平的表达。使用GraphPad Prism 9软件对数据进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用Tukey检验。结果(1)6组小鼠mNSS评分差异有统计学意义(F=66.35,P<0.001)。脑出血组[(8.00±1.46)分]mNSS评分高于假手术组[(0.86±0.83)分](P<0.05);丰富环境组[(6.47±1.13)分]、橙皮苷组[(6.13±1.25)分]mNSS评分低于脑出血组高于联合干预组[(4.53±1.30)分](均P<0.05)。(2)6组脑含水量百分比差异有统计学意义(F=33.29,P<0.001)。脑出血组的脑含水量高于假手术组,丰富环境组、橙皮苷组脑含水量均低于脑出血组,且高于联合干预组(均P<0.05)。(3)普鲁士蓝染色显示:脑出血组铁沉积量多于假手术组,丰富环境组、橙皮苷组铁沉积量低于脑出血组,高于联合干预组(均P<0.05)。(4)6组小鼠Nrf2、Gpx4 mRNA、蛋白表达水平差异有统计学意义(F=27.73,31.24,26.79,13.79,均P<0.001)。其中联合干预组Nrf2、Gpx4 mRNA、蛋白表达水平均高于丰富环境组和橙皮苷组,且高于抑制剂组(均P<0.05)。(5)ELISA结果显示,6组MDA、Gpx4、ROS、SOD含量变化差异具有统计学意义(F=111.20,21.53,29.45,22.75,均P<0.001)。其中联合干预组MDA、ROS[(14.05±0.57)nmol/mL,(75.46±3.40)ng/mL]低于丰富环境组[(18.17±2.51)nmol/mL,(97.23±3.43)ng/mL]、橙皮苷组[(17.24±0.68)nmol/mL,(90.02±9.46)ng/mL]和抑制剂组[(17.08±0.64)nmol/mL,(101.07±3.38)ng/mL];联合干预组Gpx4、SOD[(340.40±31.21)pg/mL,(62.55±2.81)ng/mL]高于丰富环境组[(267.81±27.17)pg/mL,(50.47±8.38)ng/mL]、橙皮苷组[(271.55±34.36)pg/mL,(50.55±8.19)ng/mL]和抑制剂组[(235.65±72.54)pg/mL,(52.67±3.56)ng/mL](均P<0.05)。结论丰富环境、橙皮苷可以通过激活Nrf2/GPX4通路抑制ICH后铁死亡的发生,对ICH小鼠模型发挥神经保护作用,且二者联合治疗效果更显著。